藻膽蛋白是源自微藻和藍(lán)**的光合作用光捕獲蛋白家族。這些蛋白質(zhì)具有共價(jià)連接的線性四吡咯基團(tuán)，稱為藻膽素，其在捕獲光能中起關(guān)鍵作用。在微藻和藍(lán)**中，由這些藻膽素吸收的能量通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）有效地轉(zhuǎn)移到葉綠素色素用于光合作用反應(yīng)。
與化學(xué)合成熒光染料相比，藻膽蛋白由于其相對(duì)高的熒光量子產(chǎn)率和消光系數(shù)而發(fā)出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。因?yàn)樗鼈兊臒晒獠槐簧锓肿逾?，所以藻膽蛋白可以在許多應(yīng)用中用作有價(jià)值的熒光標(biāo)簽。與生物分子（例如**球蛋白，蛋白A或鏈霉抗生物素蛋白）綴合的藻膽蛋白已經(jīng)在流式細(xì)胞術(shù)，熒光激活細(xì)胞分選（FACS），組織化學(xué)，成像和有限程度的活性氧物種檢測(cè)中取得了巨大成功。兩種主要類型的藻膽蛋白是市售的藻紅蛋白（PE）和別藻藍(lán)蛋白（APC）。
ReadiUse PE和APC
為了使用PE或APC進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，必須首先將熒光蛋白與抗體綴合。然而，市售的藻膽蛋白濃縮在硫酸銨懸浮液中。盡管兩者都表現(xiàn)出良好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，但它們需要繁瑣的純化過(guò)程，例如透析，硫酸鹽沉淀或凝膠過(guò)濾色譜，以在抗體綴合之前除去硫酸銨雜質(zhì)。一旦純化，PE和APC必須冷藏，不冷凍，并在一個(gè)月內(nèi)食用，以獲得*佳效果。
AAT Bioquest開(kāi)發(fā)了一種用于凍干純化的藻膽蛋白的**技術(shù)。我們的ReadiUse 藻膽蛋白系列是不含硫酸銨的凍干粉末。去除這種強(qiáng)沉淀劑消除了純化過(guò)程，并促進(jìn)PE或APC與抗體和其他蛋白質(zhì)的快速綴合。以下是使用Buccutite 快速蛋白質(zhì)交聯(lián)試劑盒（Cat＃1315）的ReadiUse PE（Cat＃2500）的方案概述：
1. 在H 2 O中重構(gòu)ReadiUse PE
2. 用Buccutite綴合激活PE和抗體
3. 混合Buccutite活化的PE和活化的抗體
4. 使用脫鹽柱凈化共軛物
比較分析：ReadiUse PE與ReadiUse APC
在本研究中，將凍干的ReadiUse PE（Cat＃2500）和ReadiUse APC（Cat＃2503）（AAT Bioquest）在各種條件下儲(chǔ)存，隨后測(cè)試其對(duì)懸浮在硫酸銨中的傳統(tǒng)藻膽蛋白的性能。在測(cè)試之前，純化傳統(tǒng)的藻膽蛋白以除去硫酸銨。對(duì)光譜特性，熒光量子產(chǎn)率和標(biāo)記效率進(jìn)行了比較。
存儲(chǔ)條件經(jīng)過(guò)測(cè)試
將ReadiUse PE和ReadiUse APC等分到1mg小瓶中，并在四個(gè)不同溫度下儲(chǔ)存兩個(gè)月。溫度包括：
· 新鮮 - 懸浮在硫酸銨中的新鮮純化的藻膽蛋白（未儲(chǔ)存，在經(jīng)驗(yàn)當(dāng)天制備）
· L - 4 o C - 凍干粉末，ReadiUse PE和ReadiUse APC儲(chǔ)存于2-8 o C
· L - RT - 凍干粉末，ReadiUse PE和ReadiUse APC在室溫下儲(chǔ)存
· L - （ - 20 o C） - 凍干粉末，ReadiUse PE和ReadiUse APC儲(chǔ)存在< - 15 o C
· L - （ - 65 o C） - 凍干粉末，ReadiUse PE和ReadiUse APC儲(chǔ)存<-65 o C
準(zhǔn)備PE和APC
在測(cè)試當(dāng)天，使用透析純化硫酸銨溶液中飽和的藻膽蛋白，以除去硫酸銨雜質(zhì)。從儲(chǔ)存中取出ReadiUse PE和ReadiUse APC，并用100μLH2O重構(gòu)，終濃度為10 mg / mL。
ReadiUse PE光譜特性
在相同的條件和濃度下測(cè)量ReadiUse PE和新鮮純化的PE在PBS中的吸光度和發(fā)射光譜。光譜比較數(shù)據(jù)總結(jié)在表3，表4和圖3中。數(shù)據(jù)表明，ReadiUse PE滿足PE的所有規(guī)格，非常穩(wěn)定，可在RT至-65o C下保存約2個(gè)月，變化很小在激發(fā)，發(fā)射和量子產(chǎn)率方面。
表3. ReadiUse PE和硫酸銨提供的PE的光譜特性比較。
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PE
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純化
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L-4 o C.
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L-RT
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L-（-20 o C）
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L-（-65 o C）
|
規(guī)格
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A565 / A280
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5.83
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5.72
|
5.72
|
5.76
|
5.77
|
> 5.6
|
|
A565 / A498
|
1.45
|
1.45
|
1.45
|
1.45
|
1.45
|
<1.5
|
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A620 / A565
|
0
|
0
|
0.003
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0.002
|
0.002
|
<0.005
|
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EM Max
|
574nm
|
574nm
|
574nm
|
574nm
|
574nm
|
574nm
|
表 4.ReadiUse PE和硫酸銨供應(yīng)的PE的量子產(chǎn)率。
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屬性
|
新鮮的（純化）
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L-4 o C.
|
L-RT
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L - （ - 20 oC）
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L - （ - 65 oC）
|
|
Ex WL
|
490nm處
|
490nm處
|
490nm處
|
490nm處
|
490nm處
|
|
Em WL
|
574nm
|
574nm
|
574nm
|
574nm
|
574nm
|
|
相對(duì)量子產(chǎn)率
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100％
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99.5％
|
97.8％
|
100％
|
99.3％
|
圖3. 凍干（ReadiUse?）PE和液體形式PE的比較。比較565至280nm和565至498nm的吸光度比率，并且還用490nm激發(fā)測(cè)量相同濃度下的相對(duì)發(fā)射強(qiáng)度，并繪制在圖中。
ReadiUse APC光譜特性
在相同的條件和濃度下測(cè)量ReadiUse APC和新鮮純化的APC在PBS中的吸光度和發(fā)射光譜。光譜比較數(shù)據(jù)總結(jié)在表5，表6和圖4中。數(shù)據(jù)表明，ReadiUse APC滿足APC的所有規(guī)格，非常穩(wěn)定，可在RT至-65 o C下保存約2個(gè)月，變化很小在激發(fā)，發(fā)射和量子產(chǎn)率方面。
表5. ReadiUse APC和硫酸銨提供的APC的光譜特性比較。
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APC
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新鮮的（純化）
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L-4 o C.
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L-RT
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L - （ - 20 oC）
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L - （ - 60 oC）
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規(guī)格
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A651 / A280
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5.18
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4.98
|
4.95
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4.62
|
4.95
|
> 4.6
|
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A651 / A620
|
1.57
|
1.53
|
1.53
|
1.53
|
1.53
|
> 1.5
|
|
EM Max
|
661.00納米
|
660.00納米
|
660.00納米
|
660.00納米
|
660.00納米
|
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表6. ReadiUse APC和硫酸銨提供的APC的量子產(chǎn)率。
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屬性
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新鮮的（純化）
|
L-4 o C.
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L-RT
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L - （ - 20 oC）
|
L - （ - 65 oC）
|
|
前WL
|
630納米
|
630納米
|
630納米
|
630納米
|
630納米
|
|
Em WL
|
661.01 nm
|
660.00納米
|
660.00納米
|
660.00納米
|
660.00納米
|
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相對(duì)量子產(chǎn)率
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100％
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98.7％
|
97％
|
97％
|
97％
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圖4.凍干（ReadiUse）APC和液體形式APC的比較。比較光譜性質(zhì)，并用630nm激發(fā)測(cè)量相同濃度下的相對(duì)發(fā)射強(qiáng)度。